ImageStream是一种台式多谱段成像流式细胞仪（Multispectral Imaging Flow Cytometry），能够同时采集6个检测通道中的细胞图像（图1）。它将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一身，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的信息。
 
ImageStream流式细胞成像系统
与传统流式细胞仪很类似，ImageStream也是由液流系统，光学系统和电子系统等三大部分组成。液流系统将样本细胞悬液和系统鞘液注入流动室中，使细胞在鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过检测窗口。光学系统中光源照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号。光源分为两种，其一是用于产生明场细胞图像的卤灯（Brightfield Illuminator），另一种是用于产生荧光细胞图像的激光器。光源照射细胞产生的光信号被具有很大数值孔径（NA：0.75）的物镜收集，然后通过光路系统传递到由二向色镜构成的滤光片堆栈（Dichroic Filter Stack），光信号在这里被分成不同波段投射到一个六通道冷CCD上，产生一个明场细胞图像，一个暗场细胞图像（Side Scatter，SSC）及四个不同荧光通道的细胞图像。ImageStream的光路系统能够自动调整焦距，并实时测定细胞运动速度，而其冷CCD采用时间延迟积分方式

ImageStream系统配有功能强大的数据分析软件IDEAS，可以对每个细胞分析超过500种量化参数。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，还包括对细胞形态，细胞结构及亚细胞信号分布的分析。通过在细胞群体中对这些参数进行统计，分析软件可以生成细胞群体的散点图和柱状图，而这些统计数据与细胞图像是完全整合的，比如点击散点图上的点，就可以直观的看到这个点代表的细胞的图像。另外，使用者还能够根据自身研究的特殊需要，进行自定义参数的设定，进行更深入的分析。


IDEAS分析软件
ImageStream流式细胞成像系统结合了流式细胞检测功能与荧光显微成像功能，并整合了功能强大的分析软件，几乎可应用于细胞分析的所有领域，大大深化和拓展了流式细胞术的应用。下面简要列举一些ImageStream的新颖应用。
1. 细胞信号转导/通路分析 (Cell Signaling/ Pathway Analysis）
细胞信号通路中关键因子的磷酸化水平和在细胞内的分布是细胞信号转导研究的重要内容。ImageStream系统结合流式细胞术与荧光显微成像的检测方式，一方面可以统计细胞内因子的磷酸化程度，一方面可以通过分析细胞图像来确定信号因子在亚细胞水平定位的变化，因而非常适合进行这方面的研究。

转录因子从细胞质转移到细胞核（Nuclear Translocation）是细胞信号转导的重要事件。传统的检测方法是使用荧光显微镜进行观察，但是这种方法效率很低，所能观察的细胞数量十分有限，且很难对不同细胞的转位程度进行评估。为了更有效的检测Nuclear Translocation，ImageStream系统在IDEAS分析软件中引入了一个全新的参数—Similarity，来对采集的细胞图像进行分析。所谓Similarity，是指两个不同荧光检测通道采集的荧光图像在空间分布上的一致性（图3）。Similarity值越高，则两张细胞图像上的信号分布越相似。对于Nuclear Translocation研究来说，Similarity值越高，细胞因子转位的程度就越高。


NF-κB是一类重要的转录因子，能够在多种组织中激活不同基因的表达，与慢性和急性炎症，自身免疫性疾病及多种癌症的发生存在着联系。脂多糖（LPS）能够激活人类单核细胞系THP-1的一个信号通路，导致NF-κB的转位。研究人员使用LPS处理细胞，Alexa Fluor 488标记的抗NF-κB抗体和7-AAD染色细胞，利用ImageStream进行检测。在散点图上以一定的Siminlarity值设门，定量分析NF-κB转位的细胞亚群所占比例，然后通过观察细胞图像，确认结果的准确性。分析显示，LPS处理后，细胞内的NF-κB发生了明显的转位，细胞群体的Median Similarity值由-1.358变为2.114，发生高度转位的细胞比例从0.72%增加到45.9％。


T-bet是属于T-box家族的新型转录因子,选择性地表达于Th1细胞。研究人员利用ImageStream系统研究了这种T细胞特异性转录因子的转位情况。从T-bet敲除小鼠的脾脏和淋巴结中分离的CD4阳性细胞被转染了带有T-bet基因和GFP报告基因的质粒。T-bet位于激素诱导启动子（Estrogen receptor promoter, ER）的下游。实验采用他莫昔芬（Tamoxifen）处理细胞，观察T-bet转位的情况。T-bet用Cy3标记，细胞核用DRAQ5染色，在柱状图上设R4门，通过观察门内和门外的细胞图像，确定设门位置为Similarity值大于1.8。结果显示，他莫昔芬处理后，细胞中的T-bet转核程度有了显著的增加，发生T-bet转核的细胞百分比从22.7增加到57.9。


细胞因子可以诱导CD4阳性细胞内相关信号通路的激活，导致STAT4（signal transducer and activator of transcription 4）的磷酸化和向细胞核内转移。研究人员用IL-12处理人外周血单核细胞（PBMC），然后用抗pSTAT4和CD4的抗体及DRAQ5染色，利用ImageStream检测pSTAT4的转位。结果表明，IL-12处理半小时后，pSTAT4发生了明显的向细胞核内的转移。

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